موضوع پایان نامه - تحقیق کامل

متن کامل پایان نامه را در سایت منبع fuka.ir می توانید ببینید1-10-5- تثبیت بوسیله به دام انداختن در یک ژل پلیمری یا کپسول …………………………………………………….15
1-11- کپسوله کردن آنزیم و روش محصور کردن …………………………………………………………………………………… 16
1-11-1- مزیت های تثبیت آنزیم در میکروکپسول ها ……………………………………………………………………………..16
1-11-2- تکنولوژی انکپسوله کردن برای کاربردهای غذایی …………………………………………………………………….17
1-12- اتلاف فعالیت آنزیم های تثبیت شده و ویژگی های آن ها …………………………………………………………… 18
1-13- تکنولوژی نوین آنزیم برای کاربردهای غذایی ………………………………………………………………………………….19
1-14- هیدرولیز لاکتوز و مزایای هیدرولیز لاکتوز شیر ………………………………………………………………………….. 20
1-15- هیدرولیز لاکتوز آب پنیر ………………………………………………………………………………………………………………..21
1-16- کاربردهای بالقوه آب پنیر هیدرولیز شده …………………………………………………………………………………….21
1-18- کاربردهای تثبیت آنزیم لاکتازدر صنعت فرآوری موادغذایی …………………………………………………………21
1-19- ویژگی های آنزیم لاکتاز حاصل از منابع مختلف …………………………………………………………………………..23
1-20- فاکتورهای موثر در هزینه فرآیند تثبیت ………………………………………………………………………………………..25
2- مواد و روش ها ………………………………………………………………………………………………………………………………………26
2-1- طرح آزمایش و تجزیه و تحلیل آماری …………………………………………………………………………………………….27
2-2- مواد شیمیایی و تجهیزات مورد استفاده در آزمایش ها ……………………………………………………………………29
2-3- طراحی بیوراکتور و مشخصات ستون بیوراکتور …………………………………………………………………………….. 31
2-4-دیاگرام خط تولید شیر کم لاکتوز برای آزمایش ها ……………………………………………………………………………33
2-5-روش تولید و ساخت شیر کم لاکتوز (غیر مداوم و مداوم ) ……………………………………………………………….34
2-6- روش اندازه گیری درصد هیدرولیز لاکتوز ………………………………………………………………………………………….35
2-7- نحوه تثبیت آنزیم در سدیم آلژینات و رخداد های تثبیت آنزیم در آلژینات …………………………………….35
3- نتیجه گیری ……………………………………………………………………………………………………………………………………………..38
3-1- درصد هیدرولیز لاکتوز شیر…………………………………………………………………………………………………………………39
3-1-1- آنالیز واریانس مدل ……………………………………………………………………………………………………………………….40
3-2- اثر دما روی آنزیم لاکتاز ……………………………………………………………………………………………………………………..42
3-2-1- اثر غلظت آنزیم تثبیت شده …………………………………………………………………………………………………………..44
3-3- اثر غلظت آلژینات روی کارایی بیوراکتور ………………………………………………………………………………………….45
3-3-1- اثر فلوریت روی کارایی ستون ………………………………………………………………………………………………………46
4- بهینه سازی و نتیجه گیری کلی ……………………………………………………………………………………………………………47
4-1- نتیجه گیری کلی ……………………………………………………………………………………………………………………………….48
4-2- پیشنهادات ………………………………………………………………………………………………………………………………………….49
چکیده انگلیسی …………………………………………………………………………………………………………………………………………….50
پیوست …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..52
منابع
عنوان فهرست جداول صفحه
جدول 1-1-منابع مختلف آنزیم لاکتاز و عامل های تثبیت کننده …………………………………………………………..24
جدول 1-2- هیدرولیز لاکتوز با تکنیک های مختلف تثبیت ……………………………………………………………………..25
جدول 2- 4 –طراحی آزمایشات ………………………………………………………………………………………………………………… 28
جدول 2-5 – آنالیز واریانس مدل ………………………………………………………………………………………………………………..40
جدول 4-1-مقادیر بهینه جهت تولید شیر کم لاکتوز با هدف حداکثر هیدرولیز لاکتوز و کمینه بودن دبی جریان شیر ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………47
جدول 4-2-مقادیر بهینه جهت تولید شیر کم لاکتوز با هدف حداکثر هیدرولیز لاکتوز و بیشینه بودن دبی جریان شیر……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..47
عنوان فهرست اشکال صفحه
شکل 1-1-تصویر سه بعدی آنزیم لاکتاز حاصل از E.Coli …………………………………………………………………………..4
شکل 1-2- لاکتوز اندازه گیری شده به روش نقطه انجماد وکروماتوگرافی مایع ………………………………………….9
شکل 1-3-آنزیم بنزآلدئید لیاز به همراه زنجیره اش از طریق حامل اصلاح شده با نیکل تثبیت شده و تشکیل بنزوئین را کاتالیز می کند ………………………………………………………………………………………………………………..14
شکل 1-4-متراکم شدن و اتصال عرضی آنزیم ها برای ایجاد یک CLA (توده های آنزیمی اتصال عرضی شده ) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………15
شکل 2-1- طراحی Packed Bed Bioreactor ……………………………………………………………………………………31
شکل 2-2 -دیاگرام خط تولید شیر کم لاکتوز ……………………………………………………………………………………………33
شکل 2-3- نحوه تثبیت آنزیم به روش محصور کردن …………………………………………………………………………………36
شکل3-1- کانتورپلات نشان دهنده اثر دما و غلضت آنزیم بر درصد هیدرولیز لاکتوز موجود در شیر ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..43
شکل 3- 2 – نمودار سطحی نشان دهنده اثر فلوریت و غلظت آلژینات بر درصد هیدرولیز لاکتوز موجود در شیر ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….46
مقدمه
شیر کم لاکتوز محصولی است که با تبدیل لاکتوز موجود در شیر به قند های ساده یعنی گلوکز و گالاکتوز ،مرحله هضم اولیه روی آنها صورت گرفته و بنابراین هنگام خورده شدن شیر مذکور توسط فرد مبتلا به عارضه عدم تحمل لاکتوز ،قندهای ساده به راحتی از جداره روده جذب خون می شود و لاکتوز باقی مانده نیز تحت تاثیر فعالیت جرئی آنزیم لاکتاز روده ای هضم و جذب می شود لذا علائم و ناراحتی های روده ای بروز نخواهد کرد .مصرف این محصول توسط افراد مبتلا به عارضه عدم تحمل لاکتوز در مقایسه با مصرف شیر معمولی که لاکتوز هضم و جذب نشده به مصرف باکتریهای روده می رسد ،اثرات فیزیولوژیکی مثبت تغذیه ای و انرژی زایی مشابه فرد سالم را به دنبال خواهد داشت .
موسسه ملی بیماری های دیابت و کلیوی ،برآورد کرده است که در حدود 75 درصد جمعیت بزرگسال آمریکایی و 90 درصد آمریکایی های آسیایی دارای بیماری عدم تحمل لاکتوز هستند .
در این مطالعه با به کار گیری روش سطح پاسخ تاثیر چهار پارامتر غلظت آنزیم ،غلظت آلژینات ،دما و سرعت جریان شیر از بیوراکتور ستونی ،بر شاخص درصد هیدرولیز لاکتوز مورد ارزیابی قرار می گیرد و شرایط بهینه تولید شیر کم لاکتوز به روش مداوم بررسی می شود ؛تا بتوان به سوالات زیر در پاسخ داد :
1-دمای بهینه بیوراکتور آنزیمی چقدر می تواند باشد ؟
2-اثرات غلظت آنزیم و آلژینات روی کارایی بیوراکتور به چه نحوی است ؟
3-سرعت جریان شیر از ستون چه اثری روی درصد هیدرولیز لاکتوز شیر دارد ؟
در واقع در این مطالعه با طراحی یک بیوراکتور آنزیمی مناسب ،شرایط بهینه تولید شیر کم لاکتوز به روش مداوم مورد بررسی قرار می گیرد .
1-مروری بر تحقیق
1-1-فواید مصرف فرآورده های لبنی و سرانه مصرف شیر :
امروزه مصرف شیر و فرآورده های آن بعنوان یکی از شاخص های توسعه جوامع انسانی بیان می شود .تحقیقات مستمر انجام گرفته در مورد مصرف فرآورده های لبنی نشان داده است که ارتباط نزدیک و مستمری بین مصرف این فرآورده ها و سطح سلامتی افراد جامعه به لحاظ کارایی و ضریب هوشی ،میزان ابتلا به بیماری های عفونی و تنظیم فعالیت های متابولیکی بدن وجود دارد .در حال حاضر صنایع تولید و فرآوری شیر و مشتقات آن یکی از مهم ترین و گسترده ترین صنایع غذایی محسوب می شود .بطوریکه در طی دهه اخیر شاهد رشد چشمگیر این صنعت و افزایش تولید محصولات لبنی در کشورمان بوده ایم .
علیرغم این رشد تولید ،سرانه مصرف در کشورمان افزایش چندانی نداشته است ،بطوریکه ایران با مصرف سرانه حدود 85 کیلوگرم شیر بسیار دورتر از مصرف سرانه جهانی ( 155 کیلوگرم ) قرار می گیرد .پایین بودن سرانه مصرف به عوامل متعددی مربوط می گردد ؛از جمله عدم تنوع این محصولات ،بالا بودن متوسط قیمت آنها در مقابل درآمد متوسط خانوارهای ایرانی ،فقدان آگاهی و فرهنگ مصرف فرآورده های لبنی و وجود حساسیت و عدم تحمل نسبت به بعضی از ترکیبات شیر .
طی سالهای اخیر تلاشهای زیادی چه از طرف بخش صنعت و چه از طرف ارگان های متولی بهداشت و سلامت جامعه در جهت افزایش سطح آگاهی مصرف کننده صورت گرفته است و از طرف دیگر با افزایش تولید و ایجاد تنوع در نوع محصولات جذابیت های مصرف این محصولات نیز افزایش یافته است .منتهی به نظر می رسد برای حصول به هدف افزایش سرانه مصرف باید فاکتور مهمی نظیر واکنش حساسیت زای بعضی از ترکیبات شیر را که باعث پس زنی این محصول توسط آحاد جامعه می شود را مد نظر داشته و برای حل این معضل چاره ای اندیشید (2) .
1-2-بیماری عدم تحمل لاکتوز :
در میان ترکیبات شیر ،قند شیر یا لاکتوز مهم ترین عامل حساسیت زای شیر محسوب می شود .این قند در طی مراحل هضم توسط آنزیم لاکتاز (بتاگالاکتوزیداز) روده ای به دو قند ساده گلوکز و گالاکتوز شکسته شده و سپس از طریق جدار مخاطی روده جذب جریان خون می شود .در صورت فقدان یا کاهش فعالیت این آنزیم ،لاکتوز موجود در مواد لبنی به صورت دست نخورده وارد روده بزرگ شده و در آنجا تحت تاثیر میکروارگانیسم های روده ای تخمیر می گردد .نتیجه فعالیت تخمیری این میکروارگانیسم ها روی لاکتوز تولید اسید لاکتیک ،اسیدهای چرب کوتاه زنجیر و گازهای CO2 ، H2 و CH4 خواهد بود ،که نهایتا منجر به بروز عوارض و علایم کلینیکی ناخوشایندی برای مصرف کننده می شود .
شدت این علایم می تواند بسته به شرایط فیزیولوژیکی هر فرد متفاوت باشد و می تواند از یک شکم درد و نفخ مختصر تا دلپیچه های شدید ،اسهال و تهوع ، متغیر باشد .علاوه بر این عادات غذایی شخص ،نوع و ترکیب ماده لبنی و میزان مصرف نیز بر شدت و ضعف این علائم تاثیر می گذارند .
چنین عارضه ای را بر اساس شدت و ضعف علائم بالینی به دو گروه عدم تحمل لاکتوزو یا سوء هاضمه نسبت به لاکتوز تقسیم می کنند .این عارضه در اکثر نژادهای بشری بصورت ژنتیکی وجود دارد ،به این صورت که فعالیت آنزیم لاکتاز روده ای در انسان با افزایش سن کاهش می یابد (53) .
-اثرات لاکتوز در روده بزرگ:
لاکتوز اضافی در روده بزرگ می تواند منجر به موارد ذیل گردد:
1- آب گیری بافت با توجه به اثرات اسمزی 2- جذب ضعیف کلسیم با توجه به اسیدیته پائین 3- تخمیر لاکتوز توسط فلور میکروبی که موجب تولید گازهای دی اکسید کربن و هیدروژن شده و می تواند ناراحتی هایی از قبیل دل درد ،اسهال ،استفراغ و نفخ را در پی داشته باشد (53) .
1-2-1-عارضه عدم تحمل لاکتوز در مناطق مختلف :
مطالعات نشان می دهد که افراد مبتلا نسبت به مقادیر کم لاکتوز ( 0 – 2 گرم لاکتوز ) واکنش خاصی نشان نمی دهند و بروز علایم با مصرف مقادیر بیشتر لاکتوز ( بیش از 6 گرم ) مشاهده می شود.میزان ابتلا به این بیماری در مناطق گوناگون نیز متفاوت می باشد.کمترین درصد ابتلا در مناطق قفقاز و شمال اروپا دیده می شود ؛ (کمتر از 3% جمعیت بزرگسال ) بیشترین میزان ابتلا در آمریکای جنوبی و پاره ای از مناطق آسیا (تقریبا 100 % جمعیت بزرگسال ) دیده می شود .در مورد جمعیت مبتلا در ایران متاسفانه تا کنون مطالعه خاصی صورت نگرفته ولی با استناد به بعضی از تحقیقات انجام شده در کشورهای هم جوار و در بعضی از مقالات رقم 85 % جمعیت بزرگسال یا به عبارت دیگر حدود بیش از 9 میلیون نفر برای ایران ذکر شده است .البته قابل پیش بینی است که بدلیل عدم تمایل به مصرف مواد لبنی از سوی چنین جمعیت قابل توجهی از جمعیت کشور ،خطر شیوع بیماریهای ناشی از کمبود کلسیم و نیز سوء تغذیه را افزایش خواهد داد .در کشور های پیشرفته این معضل با تهیه و عرضه محصولات لبنی کم لاکتوز و حتی بدون لاکتوز تا حد بسیار زیادی بر طرف شده است (53) .
1-3-لاکتوز شیر:
لاکتوز یک دی ساکارید متشکل از یک واحد گلوکز و یک واحد گالاکتوز می باشد .شیر گاو بطور متوسط دارای 4/8 درصد قند لاکتوز می باشد یا به عبارتی هر فرد هنگام نوشیدن یک لیوان شیر( 250 میلی لیتر) تقریبا 12 گرم لاکتوز وارد دستگاه گوارش خود می کند. به منظور کاهش عوارض ناشی از عدم تحمل لاکتوز ،طبق منابع حداقل باید 75 % میزان لاکتوز موجود در شیر کاهش یابد تا به کمتر از 1 درصد برسد. وزن مولکولی لاکتوز 342/3 گرم بر مول است .در دمای اتاق ساکارز 10 بار محلول تر از لاکتوز است (22).
-آنزیم لاکتاز:
روی بخش فعال آنزیم لاکتاز دو گروه کربوکسیلی شناخته شده است ،یکی از این گروه های کربوکسیلی اکسیژن گلیکوزیدیک را پروتونه می کند و منجر به شکسته شدن پیوند گلیکوزیدیک سوبسترا (لاکتوز) می شود .گروه کربوکسیلیک دیگر هم به صورت یک نوکلئوفیل رفتار می کند و کوالانت آنزیم – گالاکتوزیل میانی را می سازد .(Zechel & Whiters) (37) .

شکل 1-1-تصویر سه بعدی آنزیم لاکتاز حاصل از E.Coli
-هیدرولیز آنزیمی لاکتوز شیر:
متداولترین روش برای کاهش لاکتوز استفاده از روش های آنزیمی است. به این صورت که به شیر آنزیم لاکتاز یا بتا گالاکتوزیداز استحصال شده از منابع مختلف (معمولا از قارچ ،مخمر و یا باکتری) افزوده شده و آنزیم فوق عمل هیدرولیز یا شکستن مولکول لاکتوز را به صورت زیر انجام می دهد:

همانگونه که ملاحظه می گردد ،حاصل عملیات هیدرولیز آنزیمی لاکتوز تشکیل مونو ساکارید های گلوکز و گالاکتوز و به میزان محدودی الیگو ساکاریدها می باشد (13) .
1-4-هیدروکلوییدها :
هیدروکلوئیدها پلی مرهای کربوهیدراتی با وزن مولکولی بالا هستند که در صنعت غذا به منظور ویژگی های عملکردی مهمی چون ،غلیظ کردن ،تشکیل هیدروژل و پایداری بافت به کار گرفته می شوند .ژلان ،آگار ،کاپا کاراگینان و سدیم آلژینات پر مصرف ترین هیدروکلوئیدها از لحاظ عامل های ژل ساز هستند .هیدروژل ها سیستم های پویایی هستند که از شبکه های سه بعدی پلی مری تشکیل شده اند .اکثر هیدروژل ها به کمک اثرات متقابل یونی و یا حرارتی ساخته می شوند .این مواد در زمینه هایی مانند آزاد شدن کنترل شده داروها ،تثبیت کنترل شده ،جداسازی زیستی ،بیوسنسورها و بافت های مصنوعی خیلی مفید هستند (11) .
-آلژینات:
سدیم آلژینات یک نمک محلول در آب آلژنیک اسید است .و به صورت یک پلی ساکارید غیر سمی در تمام گونه های جلبک قهوه ای وجود دارد .این ماده به طور گسترده در صنایع غذایی و دارویی استفاده می شود . و امروزه هم برای محصور کردن داروها ،ماکرومولکول ها و سلول های بیولوژیکی استفاده می شود .آلژینات به واسطه اثر متقابل با یون های مثبت دو ظرفیتی به غیر از منیزیوم ،ژل های آبدوست تشکیل می دهد .ژله ای شدن در اثر اتصال عرضی یون های دو ظرفیتی با واحدهای اورونیک اسید اتفاق می افتد .حضور یون کلسیم در محیط این ژل سبب اتصال پلی مرهای گلورونیک اسید به یکدیگر و ایجاد ساختاری موسوم به جعبه تخم مرغی می شود . (31) و (23) .
-واکنش شیمیایی در ژل :
در ژل ها واکنش های شیمیایی تقریبا نظیر یک محیط مایع صورت می گیرد و حالت ساختمانی ژل فقط به میزان کمی بر سرعت انجام چنین واکنش هایی اثر می گذارد .و نیز مواد محلول در فاز مایع با همان سرعتی که در یک حلال خالص نفوذ می کنند می توانند در ژل نیز نفوذ نمایند (4) .
1-5-ویژگی های شیر کم لاکتوز:
با تشکیل مونوساکارید های گلوکز و گالاکتوز و با توجه به شیرینی نسبی بالاتر آنها ( 0/6) نسبت به شیرینی نسبی دی ساکارید لاکتوز ( 0/27 ) شیر کم لاکتوز طعم شیرین ملایم و مطبوعی پیدا می کند. البته لازم به ذکر است که این شیرینی به معنی افزایش درصد قند نبوده و تاثیری بر میزان کالری زایی محصول ندارد. به غیر از طعم بهتر این شیرها ،به دلیل تاثیرات مثبت گلوکز و گالاکتوز بر سلامتی این شیرها از خواص تغذیه ای بهتری برخوردارند. قند گلوکز مهمترین کربوهیدرات بدن انسان بوده و کلیه فعالیتهای متابولیکی بدن به کمک آن صورت می گیرد. علاوه بر این گلوکز موجب تحریک ترشح انسولین شده و همچنین تاثیر مثبتی بر کاهش کلسترول بد خون دارد. گالاکتوز قندی است که در ساختار سلولهای عصبی بدن وجود دارد ،این قند همانند گلوکز سریع جذب می شود ولی تحریک کننده ترشح انسولین نیست و بنابراین موجب حفظ قند خون به مدت طولانی تری می گردد (2) .
1-5-1-به چه شیری کم لاکتوز گفته می شود ؟
بنابر مطالعات انجام گرفته توسط هرتزلر و همکاران ( 1996 ) براساس اندازه گیری میزان هیدروژن تولیدی پس از مصرف شیر ،شیرهای حاوی 2- 0 % لاکتوز ،کم لاکتوز محسوب شده و هیچگونه مشکل هضم و عدم تحمل در مصرف کننده بوجود نمی آورند (42) .
1-6-روش نقطه انجماد :
اساس عمل اندازه گیری نقطه انجماد ،قانون رائولت است و می توان گفت که حضور لاکتوز به عنوان ماده حل شونده می تواند مطابق این قانون سبب کاهش نقطه انجماد شود .ولی از آنجا که شیر یک محلول پیچیده و حاوی مواد حل شونده قندی و انواع نمک است ،به همین دلیل ممکن است حضور آنها نیز به نوبه خود ،این ویژگی فیزیکی را تحت تأثیر قرار دهد (35) .
Chen و همکاران از نقطه انجماد برای تعیین درجه آبکافت لاکتوز استفاده کردند .استفاده از روش نقطه انجماد به عنوان روشی بسیار مناسب ،ساده ،دقیق و کم هزینه برای ارزیابی درصد لاکتوز و آبکافت شیرهای تیمارشده با آنزیم توصیه می شود (14) .
Nijplels و همکاران از دو روش آنزیمی و روش اندازه گیری نقطه انجماد برای تعیین میزان لاکتوز شیر و شیرهای تیمار شده با آنزیم بتا-گالاکتوزیداز استفاده کردند و میزان ضریب تعیین دو روش را حدود 0.994 اعلام کردند (28) .
– نقطه انجماد شیر:
مواد محلول در یک حلال مایع ،عموماً باعث کاهش نقطه انجماد حلال می شود و کاهش انجماد معمولاً با غلظت ماده حل شده متناسب است .هنگامی که آب به شیراضافه شود ،غلظت نمک ها و لاکتوز محلول در سرم کاهش می یابد و بر اثر رقیق شدن شیر ،نقطه انجماد شیر تدریجاً به سمت نقطه انجماد آب خالص نزدیک می شود . 75 درصد افت نقطه انجماد مربوط به لاکتوز و کلرورها بوده و تغییر غلظت یکی از آنها (لاکتوز یا کلرور ) باعث تغییر غلظت ماده دیگر می شود ( برای حفظ تعادل ) .
نقطه انجماد0/535 H – هورت وت را دربعضی مناطق جهان بعنوان نقطه انجماد طبیعی شیر پذیرفته اند . شیری که نقطه انجماد آن مساوی یا کمتر از عدد فوق باشد ؛بعنوان شیر بدون آب اضافی محسوب می شود .در هر صورت اندازه گیری نقطه انجماد نمونه های مورد اعتماد و صحیح شیر به منظور ارائه شاهد و مدرک افزایش آب ضرورت دارد (1) .
1-6-1-عوامل موثر درتغییرات نقطه انجماد شیر:
شواهد نشان می دهد که تغیرات نقطه انجماد با عواملی مانند فصل ، سن و سلامت و نژاد گاو ،علوفه ، دسترسی دام به آب ،آب و هوا ،دمای محیط ،زمان شیر دوشی ( صبح یا عصر ) و احتمالاً عوامل دیگر بستگی دارد .همچنین تخمیر شیر ،فرآیند شیر در خلاء ،استریل کردن شیر و انجماد و نگهداری نمونه ها قبل از آزمایش بر نقطه انجماد اثر می گذارد .افزایش ماده خشک شیر ،نقطه انجماد را بطور محسوسی کاهش می دهد .برخی از میکروب ها مانند سود موناس ها می توانند قبل از رسیدن شیر به برودت لازم موجب تشکیل ذرات یخ در شیر گردند .گرم کردن چنین شیری تا 38 درجه سانتی گراد و سپس سرد کردن آن ،اندازه گیری نقطه انجماد صحیح شیر را ممکن می سازد .
نتایج نقطه انجماد نمونه هایی که اسیدیته آنها یشتر از 17 درجه دورنیک است ،نقطه انجماد صحیح شیر را نشان نمی دهد .این روش علاوه بر شیر خام ،برای اندازه گیری نقطه انجماد شیر کامل ،شیر پس چرخ ،شیر کم چربی ،شیر فرادما و شیر هموژنیزه نیز کاربرد دارد .استریل کردن شیر و پاستوریزه کردن در خلاء ، ممکن است بر نقطه انجماد شیرموثر باشد (1) .
-اصطلاحات نقطه انجماد :
– نقطه انجماد :
دمایی است که درآن دما فاز مایع و فاز بلورین یک ماده در حالت تعادل قرار دارد .
– نقطه انجماد شیر :
دمایی است که مطابق روش کریوسکوپی اندازه گیری شده و بر حسب درجه H ( هورت وت ) یا درجه سلسیوس بیان می شود .
– افت نقطه انجماد :
نقطه انجماد آب خالص صفر درجه است ،مواد محلول در یک حلال مایع نقطه انجماد را کاهش می دهد .
– درصد آب اضافی:
افزودن آب به یک محلول ، نقطه انجماد آن را افزایش می دهد که میزان این افزایش متناسب با میزان آب اضافی است (1) .
1-6-2-اصول روش نقطه انجماد :
سرد کردن سریع نمونه شیر تا دمای مناسب ( پائین تر از نقطه انجماد ) که بستگی به نوع کریوسکوپ دارد و آغاز کریستاله شدن بر اثر ضربه مکانیکی که باعث می شود دما به سرعت افزایش یافته و دامنه مسطحی بر روی منحنی نقطه نقطه ،انجماد را نشان دهد که معادل نقطه انجماد نمونه شیر است (1) .
1-6-3-افت نقطه انجماد و درصد آب کافت لاکتوز :
به ازای1درصد آبکافت لاکتوز ،نقطه انجماد شیر 0/0028 درجه سانتی گراد کاهش می یابد .همچنین ،در آبکافت کمتر از 88 درصد ،ارتباط خطی بسیار خوبی ،بین نقطه انجماد و آبکافت لاکتوز وجود دارد .ولی با افزایش میزان آبکافت ،این ارتباط کم می شود .
Nijplels و همکاران گزارش کردند که نقطه انجماد محلول آبی لاکتوز را می توان به کمک رابطه XK/M – ΔT = بدست آورد . ΔT : کاهش نقطه انجماد ،X : غلظت ماده حل شونده ،K : ضریب ثابت کرایواستار معادل 1/86 و M وزن مولکولی ماده حل شونده است . آن ها گزارش کردند که با توجه به این رابطه ،در اثر آبکافت کامل محلول5 درصد لاکتوز ،نقطه انجماد آن0/273 – درجه سانتی گراد کاهش می یابد (42) .
1-6-4-روش نقطه انجماد و کروماتوگرافی مایع و کلرآمین ،در اندازه گیری لاکتوز:
ارتباط خوبی بین میزان لاکتوزِ اندازه گیری شده توسط روش کروماتوگرافی مایع درشیرهای تیمار شده توسط آنزیم بتا-گالاکتوزیداز با میزان لاکتوز محاسبه شده توسط روش نقطه انجماد وجود دارد .این دو روش از نظر سنجش میزان لاکتوز شیر ،تفاوت چندانی نسبت به هم نداشتند .این موضوع ،بیانگر ارتباط تنگاتنگ و قابل اعتماد بین این دو روش است .به بیان دیگر ،از روش نقطه انجماد می توان به عنوان یک روش قابل اعتماد برای اندازه گیری میزان لاکتوز یا تعیین میزان آبکافت آن استفاده کرد. در ضمن ،میزان لاکتوز اندازه گیری شده توسط روش نقطه انجماد ،اندکی کمتر از روش کروماتوگرافی مایع است که این موضوع ممکن است به دلیل تشکیل چند قندی ها طی فرآیند آبکافت آنزیمی لاکتوز و تداخل آن ها باشد .
در ضمن ،روش کلرآمین T روش نسبتا دقیقی برای تعیین میزان لاکتوز در شیرهای تیمار نشده تشخیص داده می شود . هر دو روش ،نقطه انجماد و کروماتوگرافی مایع روش های مناسب و قابل اطمینانی برای اندازه گیری لاکتوز شیر در دامنه 0/5 تا 5 درصد بوده ، ولی روش کلرآمین فقط در غلظت های بالای لاکتوز 2 تا 5 درصد روش مناسبی است (3) .

شکل 1-2- لاکتوز اندازه گیری شده به روش نقطه انجماد وکروماتوگرافی مایع
1-7-تعریف آنزیم :
--------------------------------------------------- نکته مهم : هنگام انتقال متون از فایل ورد به داخل سایت بعضی از فرمول ها و اشکال (تصاویر) درج نمی شود یا به هم ریخته می شود یا به صورت کد نمایش داده می شود ولی در سایت می توانید فایل اصلی را با فرمت ورد به صورت کاملا خوانا خریداری کنید: سایت مرجع پایان نامه ها (خرید و دانلود با امکان دانلود رایگان نمونه ها) : elmyar.net --------------------------------------------------- شاید بهترین تعریف موجود عبارتی باشد که در مقدمه کتاب دیکسون و وب (1979) به آن ارائه شده ؛که در آن آنزیم به عنوان ” یک پروتئین با خواص کاتالیزوری ناشی از قدرت فعالیت ویژه آن ” تعریف گردیده است (41) .
در واقع اغلب واکنش های آنزیمی ،کمپلکس های حد واسط برگشت پذیر را در برمی گیرند .بنابراین یک آنزیم در طی واکنش مصرف نمی شود ،بلکه می تواند بارها و بارها مورد استفاده قرار گیرد .در حقیقت عدد تبدیل آنزیم یعنی ،تعداد مولکول های سوبسترایی که در حضور آنزیم کاملا اشباع در واحد زمان به فرآورده تبدیل می شوند ،می تواند فوق العاده بالا باشد .این رقم در مورد اغلب آنزیم ها در حدود 10000در هر ثانیه است(46) .
طبق نظر کمیسیون آنزیم میزان یک میکرومول بر دقیقه به عنوان یک واحد فعالیت آنزیم تعریف شده است .هر چند در سال های اخیر به کارگیری واحدSI فعالیت آنزیم یعنی کاتال به طور فزاینده ای معمول گردیده است .این واحد عبارت است از مقدار آنزیمی که تبدیل یک مول سوبسترا در ثانیه را کاتالیز می کند.
از آن جا که آنزیم ها تحت شرایط بهینه آزمایش می شوند ،فعالیت مذکور ممکن است بیانگر فعالیت حقیقی آنزیم در شرایط واقعی نباشد .فعالیت آنزیم ها به طور مشخصی از سایر عوامل نظیر pH ،دما و غلظت سوبسترا نسبت به محصول تاثیر می پذیرند .برای درک این که چگونه یک آنزیم در طی فرآین عمل می کند ،ابتدا اطلاعاتی از چگونگی فعالیت آنزیم ها تحت شرایط ایده ال لازم است (41) .
آنزیم ها قادرند به طور اختصاصی در تغییر همه ماکرومولکول های بیولوژیکی اصلی ،پروتئین ها ،هیدرات های کربن ،چربی ها و اسیدهای نوکلئیک و نیز مولکول های کوچکتر نظیر اسید های آمینه ،قندها و ویتامین ها دخالت نمایند .این دلیل اصلی اهمیت آنزیم ها در صنایع غذایی است (21) .
1-8-اثر عوامل مختلف روی فعالیت آنزیم ها :
-اثر دما روی آنزیم ها :
به طور کلی عملکرد مطلوب یا نامطلوب آنزیم ها بستگی به شرایط محیط داشته و باید همواره این شرایط مورد توجه قرار بگیرند .از جهت این که آنزیم ها مواد پروتئینی هستند ،طبیعتا عواملی که بر ویژگی های ساختمانی پروتئین ها اثر می گذارند می توانند خصوصیات عاملی آنزیم ها را نیز تحت تاثیر قراردهند .اساسا بهترین درجه حرارت برای فعالیت آنزیم ها 30 تا 40 درجه سانتی گراد است و معمولا در حرارت 45 درجه دناتوره شدن آن ها آغاز می گردد .در حرارت های زیر نقطه انجماد ،فعالیت آنزیم ها کاهش یافته و در حرارت های بسیار پایین متوقف می گردد .در انجماد علاوه براین که از آب در دسترس آنزیم کاسته می شود ،عمل تلغیظ الکترولیت ها و یون های موجود صورت گرفته که این ها باعث دناتوره شدن آنزیم می گردند . در اینجا افزایش ویسکوزیته نیز مطرح است که دسترسی آنزیم و سوبسترا به یکدیگر را کاهش می دهد (4) .
-اثر pH و فعالیت آبی روی آنزیم ها :
عامل موثر دیگر pH است ،به طور کلی pH بسیار بالا یا بسیار پایین اثر متوقف کننده روی فعالیت آنزیم دارد .آنزیم ها معمولا نیازمند یک pH خاصی برای انجام حداکثر میزان فعالیت خود می باشند .اگر چه بیش ترین اثر اکثر آنزیم ها در محدوده pH ،4/5 تا 8 است .میزان فعالیت آب یا در دسترس بودن آب در سیستم های غذایی نیز نقش تعیین کننده روی فعالیت آنزیم ها دارد .دلیل مهم کاهش فعالیت آنزیمی تحت شرایط انجماد ناشی از همین موضوع است .وجود آب آزاد به دلیل تحرک و سیالیت بخشیدن به آنزیم و سوبسترا در سیستم غذایی ،دسترسی این دو به یکدیگر را تسهیل می نماید از این رو فعالیت آنزیمی را افزایش می دهد (4) .
1-9-تثبیت آنزیم ها :
آنزیم تثبیت شده در مقایسه با آنزیم آزاد بدلیل برخوردار ی از مزایای چشمگیری مانند ،پایداری بیشتر ، کاربرد پیوسته آنزیم ،بازیابی آنزیم ،حجم کمتر واکنش ،کنترل بهتر و بازدهی بالاتر واکنش ،خلوص بیشتر محصول ،کاهش آلودگی محیط ،صرفه اقتصادی و استفاده از بیوکاتالیست تثبیت شده در گستره وسیعی از انواع بیوراکتورها روز به روز مورد توجه بیشتری قرار می گیرد (15) .
در یک تثبیت کارآمد بایستی فاکتورهای متفاوتی را درنظر گرفت تا ضمن دستیابی به بهترین توازن بین میزان پایداری و فعالیت ،فرآیند با کمترین هزینه ممکن انجام پذیرد .امکان تثبیت آنزیمها با حامل های مختلف توسط روش های ،مختلفی صورت می گیرد. معمولا ارجحیت با روشی است که کمترین صدمه را به آنزیم وارد می کند. و در این میان سیستم های با سهولت و امنیت بیشتر و هزینه کمترایده آل می باشند و روش محبوس کردن تا حد زیادی این نیاز را در اغلب موارد تامین می کند (54) .
در تثبیت آنزیمها ،پلیمر مورد استفاده می بایست غیر سمی باشد و پلیمرهای طبیعی از این نظر مناسب ترند. علاوه بر آن طبیعی بودن منبع تهیه این پلیمرها ،امکان دست یابی به آنها را راحت تر می کند. نقطه ضعف استفاده ازپلیمرها ی طبیعی در فرآیند تثبیت ،محدودیت امکان تغییر خواص آنها در رنج وسیع است(20) .
تثبیت یک آنزیم مستلزم تعامل دو گونه آنزیم و حامل بوده و بنابراین ویژگی های سطحی هر دو مهم است. در مورد آنزیم ،گروه های قطبی (مانند گروه های آمینی روی لیزین یا گروه های اسیدی روی گلوتامیک اسید) ،مناطق سطحی غیر قطبی یا بخش های قندی می توانند خواص سطحی را تحت تاثیر قرار دهند. حامل می تواند برای مطابقت با هر کدام از این خواص سطحی آنزیم ،آماده شود .نیاز ضروری برای هر حاملی ،داشتن ناحیه سطحی بالاست .این را می توان از طریق ذرات با اندازه کوچک بدست آورد ،هر چند که این باعث جدایی دشوار می شود ،یا با مواد بسیار متخلخل با منافذی با ابعاد به اندازه کافی بزرگ که نفوذ سوبسترا ها را محدود نمی کند ،بدست آورد .علاوه بر این مواد باید به صورت شیمیایی و مکانیکی پایدار باشند (50) .
در روش تثبیت آنزیم ، مولکو ل های آنزیم از طریق جذب فیزیکی یا اتصالات کوولانسی بر روی ساختاری با سطح زیاد متصل شده و یا درون ژل یا ساختارهای میکروکپسول کپسوله می شوند .به طور خاص اتصال از چند نقطه بین آنزیم و ماده یا سطح مورد استفاده برای تثبیت ،جلوی بازشدن ساختار درهم پیچیده مولکول پروتئین را می گیرد و درنتیجه ،پایداری افزایش می یابد (14) .
روش تثبیت آنزیم به علت سهولت بازیابی و احیای کاتالیست ،امکان عملیات پیوسته ،و سادگی تلخیص محصولات مورد توجه است .اما معمولا کارایی زیست کاتالیستی ضعیف آنزیم تثبیت شده ،سبب کاهش پیشبرد استفاده از فرآیندهای زیستی نسبت به فرآیندهای شیمیایی شده است .بهبود کارایی زیست کاتالیستی با ساخت ساختارهایی به عنوان حامل هایی برای تثبیت آنزیم امکا ن پذیر است (42) و (12) .
1-9-1-اهداف تثبیت آنزیم:
هدف از تثبیت آنزیم ،افزایش مقاومت آنزیم در شرایط شدید درجه حرارت ،pH ،حلال های آلی ،بازیافت و استفاده مجدد از آنزیم است .با وجود این مزایا ،کاربرد صنعتی آن به دلیل هزینه های بستر ،محدودیت های انتقال جرم ،نگرش سنتی ،تغییر در خواص (عملکرد اختصاصی) ،از بین رفتن فعالیت در طی تثبیت ،محدود شده است (19) .
1-9-2-اثرات تثبیت آنزیم روی پارامترهای سنتیکی :
ازمطالعه سنتیکی هیدرولیز لاکتوز توسط لاکتاز ،Km و Vmax برای آنزیم تثبیت شده و آزاد به صورت زیر می باشد:

همان طور که دیده می شود Vmax کمتر از Km تحت تاثیر تثبیت قرار می گیرد .به علت محصور بودن آنزیم تثبیت شده مقدار Km آن در مقایسه با آنزیم محلول بالاتر است .طبیعی است هنگام توصیف پارامترهای کنتیکی یک آنزیم ،km که مستقل از غلظت آنزیم است و Vmax که وابسته به آن می باشد معمولا به عنوان واحدها یا کاتال های فعالیت در میلی گرم پروتئین بیان می شوند .بنابراینKm بر تمایل آنزیم به سوبسترای آن و این که چگونه سرعت واکنش با افزایش [S] به حد اشباع می رسد ،دلالت دارد .لذا در اصطلاح عملی مقدارکم Km نشانگر این است که آنزیم در سطوح پائین سوبسترا کارایی موثر ( به عبارتی v بالا) و در سطوح بالای سوبسترا حالت معکوس دارد .دو آنزیم با یک مقدار Vmax ولی مقادیر کاملاٌ متفاوتKm کارایی بسیار متفاوتی در حین پروسس دارند .از این طریق می توان به وجود سوبستر ای مناسب بر ای هرآنزیمی پی برد . زیرا هرچهKm کوچکتر باشد ،سوبسترا بر ای آنزیم مناسب تر است .بطورکلی سوبسترایی مناسب تر است که نسبت Vm/Km آن کوچکتر باشد. جهت تعیین ثوابت سینتیکی آنزیم ،نیاز به بررسی رفتار سینتیکی آن می باشیم (59) .
1-9-3-مزایای آنزیم های تثبیت شده :
آنزیم ها کاتالیزورهای چندکاره ای هستندکه در زمینه های مختلفی نظیرصنایع غذایی،داروسازی ،شیمی و…به طور گسترده ای به کار گرفته می شوند .برای گسترش کاربرد آن ها در آزمایشگاها و صنایع و نیز برای اطمینان از استفاده مجدد آن ها در تولید ،نیاز به افزایش پایداری آنزیم است .تثبیت می تواند موضوع ناپایداری آنزیم را حل کند .برخی از مزایای آنزیم های تثبیت شده عبارت انداز : پایداری بیشتر آنزیم ،امکان اسفاده چند باره ازیک منبع آنزیمی و جداسازی آسان آن از مخلوط واکنش است .آنزیم ها ترکیبات نسبتا ناپایداری هستند که هزینه خالص سازی آن ها بالاست و زمانی که به صورت محلول در واکنش استفاده می شوند بازیافت آن ها از مخلوط واکنش بسیار مشکل خواهد بود .مشکل اصلی آن ها ، حساس و شکننده بودن آن ها نسبت به شرایط سخت محیطی است که منجر به این امر می شود که نیمه عمر عملکردی آنزیم کاهش یابد .بهترین و موفق ترین روش برای غلبه براین مشکل ،تثبیت آنزیم است (6) .
1-10-روش های تثبیت آنزیم:
اغلب روش های تثبیت به پنج دسته تقسیم می شوند که هرکدام مزایا و معایب خود را دارند:
1-تثبیت با جذب غیر کوالانسی
2-تثبیت از طریق فعل و انفعالات یونی
3-تثبیت با اتصالات کوالانسی
4-تثبیت به وسیله اتصال عرضی آنزیم ها
5-تثبیت به وسیله به دام انداختن در یک ژل پلیمری یا کپسول
1-10-1-تثبیت با جذب غیر کوالانسی:
جذب آنزیم بر روی حامل ها می توانند بوسیله انواع مختلفی از فعل و انفعالات انجام گیرد .آنزیم های دارای سطوح لیپوفیل بالا اتصال خوبی با یک حامل هیدروفوب ایجاد می کنند .نیروهای واندروالسی و تغییرات آنتروپی ،تثبیت آنزیم بر روی حامل را تضمین می کند .باقیمانده های قندی آنزیم های گلیکوزیله شده می تواند جذب از طریق پیوندهای هیدروژنی را اطمینان بخشند .و مناطق سطحی هیدروفیلیک زیادی از آنزیم با حامل هیدروفیل واکنش می دهند(50) .
مزیت تثبیت بوسیله تاثیرات آنتروپی یا پیوندهای هیدروژنی این است که آنزیم پیش تیمار نشده و از نظر شیمیایی تغییر نمی یابد .هم چنین امکان استفاده از آنزیم خام در این نوع تثبیت ها وجود دارد .تغییر شرایط تثبیت به مقدار زیادی نتایج را تغییر می دهد و در نتیجه می تواند دستکاری مستقیم آنزیم را ممکن سازد.عیب مهم تثبیت توسط جذب سطحی این است که آنزیم تمایل به نشت از حامل را هنگام استفاده در محیط های آبی دارد .که اگر حلال های آلی استفاده شود ،به دلیل ماندگاری ذاتی آنزیم ها در چنین محیط هایی ،این موضوع حائز اهمیت نیست(21) .
1-10-2-تثبیت از طریق فعل و انفعالات یونی :